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本文標題："初代細胞培養(yǎng)方法與步驟（豬肺）"

初代細胞培養(yǎng)方法與步驟（豬肺）

(一) 初代細胞培養(yǎng) (豬肺泡巨噬細胞)

1. 4-8週齡SPF豬以適量之citosol經(jīng)耳靜脈注射麻醉后，予以放血，剖檢取出肺

臟 ， 將 氣 管 由 下 方 1/3處 剪 斷 后 ， 以 pH 7.4， 含 0.2% EDTA無 鈣 鎂 之

Dulbecco's PBS (D-PBS) 沿氣管灌入，每次50-100 ml，經(jīng)施以數(shù)次輕柔按摩

后，再倒入覆有紗布并經(jīng)silicon處理過之滅菌好的燒杯裡。如此重覆5-7次，

至灌入的總量達500 ml為止，如此約可收肺沖洗液70-80%左右。

2. 將肺沖洗液離心，500 xg，4℃，10分鐘，打下細胞后，再加入適量 PBS

清洗，如此重複清洗三次。

3. 最后一次加入適量含10% 經(jīng)非動化胎牛血清(FBS)，100 unit/ml penicillin

及100 µg/ml streptomycin之RPMI-1640細胞培養(yǎng)液中。

4. 以0.1% Trypan blue染色，并于顯微鏡下計算細胞存活率，將存活細胞調成

2×106 cells/ml 濃度。

5. 將此濃度細胞，培養(yǎng)于24孔平板培養(yǎng)皿中(1 ml/孔)，和4孔 chamber slide中

(0.8 ml/孔)，37℃，5% CO2培養(yǎng)2小時。

6. 以PBS清洗二次，換入等量新鮮細胞培養(yǎng)液，置入37℃，5% CO2培養(yǎng)5小時，

備用。

(二) 初代細胞培養(yǎng) (雞胚胎纖維母細胞；chicken embryo fibroblast cell; CEF)

1. 選用9-11日齡雞胚，以酒精、碘酒消毒后，利用鑷子鈍端敲破蛋殼，再用

另一無菌之鑷子夾住雞胚頸部，使與卵黃囊剝離，取出雞胚。

2. 剪除頭、四肢及內臟，并將馀胚剪碎后置于消化瓶中。

3. 以每胚加3 ml PBS攪拌，去除上清液，重複清洗2～3次，直到PBS清澈無紅

血球為止，去除PBS。

4. 加入40至50 ml之0.05% Trypsin/EDTA消化液，攪拌5分鐘。

5. 以兩層滅菌紗布過濾上清液，倒入置于冰上之離心管中（內含3-5 ml 10%

非動化FBS）
。

6. 重複消化及過濾步驟3-4次（紗布需每次更換）
。

7. 以1000 rpm、10分鐘離心后，去除上清液。

8. 加入含10% 非動化FBS之MEM細胞培養(yǎng)液后，再次離心，去除上清液。

9. 于顯微鏡下計算細胞存活率，將細胞調成4×106 cells/ml 濃度。

10. 將此濃度細胞，培養(yǎng)于25 cm2培養(yǎng)瓶，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)，備用。