---
---
---(點(diǎn)擊查看產(chǎn)品報(bào)價(jià))
本文標(biāo)題："初級(jí)細(xì)胞的初代培養(yǎng)-顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞的型態(tài)"
濕度固定、空氣成分含百分之五之二氧化碳（5%CO2/95%
Air）培養(yǎng)箱。每?jī)商焯鎿Q新鮮10％FBS之DMEM/F12，培養(yǎng)細(xì)胞至第九天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
二、初級(jí)細(xì)胞的初代培養(yǎng)(Primarymixglialculture)
以麻醉劑pentobarbital將出生1天之鼠犧牲后，將其大腦
皮質(zhì)組織置于內(nèi)含penicillin-streptomycine、fungizone及
HBSS配置成的solutionD中，清除血管與殘馀軟腦膜后以機(jī)
械方式絞碎。將腦組織浸泡在細(xì)胞培養(yǎng)液及0.25%胰蛋白脢
消化液（Trypsin-EDTA）中，在37℃水浴槽靜置5分鐘待細(xì)
胞沉淀，去除上清液，加入含有10％FBS(FetalBovineSerum)
DMEMF-12培養(yǎng)液，離心(2000rpm)10分鐘。去除上清液，
加入新的細(xì)胞培養(yǎng)液并以電動(dòng)吸管（Pipet）反覆吸放數(shù)次，
溷合均勻，以紗布過(guò)濾不要的組織塊。細(xì)胞懸浮液以血球計(jì)
數(shù)器計(jì)算細(xì)胞數(shù)，再分種于預(yù)先舖有poly-L-lysine（0.02g/L）
。
處理過(guò)的12孔細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)（細(xì)胞數(shù)約為5×105cells/well）
細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、濕度固定、空氣成分含百分之五之二氧化
碳（5%CO2/95%Air）培養(yǎng)箱。每?jī)商旄鼡Q10％FBS之
DMEM/F12之培養(yǎng)液，培養(yǎng)9-12天取用細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
貳、細(xì)胞免疫染色（Immunocytochemicalstaining）
透過(guò)細(xì)胞免疫化學(xué)染色法分別鑑定培養(yǎng)之神經(jīng)細(xì)胞與溷
合膠質(zhì)細(xì)胞，以glialfibrillaryacidicprotein（GFAP）之抗體
標(biāo)示星狀膠質(zhì)細(xì)胞，以微小管相關(guān)蛋白質(zhì)-2（microtubule
associatedprotein-2，MAP-2）之抗體標(biāo)示神經(jīng)細(xì)胞，以O(shè)X-42
之抗體標(biāo)示小神經(jīng)膠細(xì)胞。藥物實(shí)驗(yàn)后，給予4％福馬林固定
15
二十分鐘，先將樣本以PBS清洗二次，目的為洗去固定液，
以0.4％TritonX-100與1％BSA溷和溶入PBS製成的Blocking
soluyion處理30分鐘，以PBS清洗后分別加入所需之一級(jí)抗
體（primaryantibody），包括
anti-MAP-2，存放于4℃反應(yīng)24小時(shí)后以PBS清洗一次，使
用二級(jí)抗體（biotinylated
immunoglobulins）反應(yīng)2小時(shí)以PBS清洗一次，加入ABC
solution反應(yīng)30分鐘，以PBS清洗一次以DAB加5％H2O2
進(jìn)行呈色反應(yīng)，并于顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞的型態(tài)。
anti-GFAP、anti-OX-42、
anti-rabbit
and
anti-mouse
參、細(xì)胞傷亡測(cè)試
一、定性:
(1)藉由顯微鏡觀察細(xì)胞型態(tài)的變化，了解細(xì)胞受損的情
況。
(2)
A.原理：
Trypanblue會(huì)直接進(jìn)入死細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞膜完
整且具有選擇性通透性，染料無(wú)法滲入而不會(huì)呈色，由此
可得知細(xì)胞存活率，此法又稱色素排除法。
Trypanblue染色法:
B.步驟：
trypanblue（0.4%）與細(xì)胞培養(yǎng)液以1:1比例充分溷合，
1ml/well加入培養(yǎng)皿，靜置30分鐘后以PBS清洗至乾
淨(jìng)，顯微鏡檢查其染色狀況。
二、定量：
MTTassay:
16
A.原理：
藥物處理過(guò)的細(xì)胞，其存活率（cellviability）可以MTT
還原法評(píng)估。健康細(xì)胞可產(chǎn)生較多之能量供細(xì)胞代謝粒腺
體內(nèi)的琥珀酸去氫酶(succinatedehydrogenase)能將MTT
3,(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)
bromide)由黃色還原為紫色之formazan結(jié)晶顆粒，而還原
力的強(qiáng)弱，即可代表琥珀酸去氫酶之活性，也就是代表代
表細(xì)胞之生理狀況以及存活率（Manthorpeetal.,1986）
。
2,5-diphenyl-tetrzolium
B.步驟：
藥物實(shí)驗(yàn)后，將溶入0.1MPBS之MTT（5mg/ml）經(jīng)
0.22µmfilter過(guò)濾，以1：9之比例加入細(xì)胞培養(yǎng)液，置
于培養(yǎng)箱中約
Isopropanol1000µl/well并反覆沖洗以便將結(jié)晶之MTT
完全溶解，取其溶解后之液體置入分光光度計(jì)中
（SHIMADZU，UV-1601，Japan）以波長(zhǎng)570nm測(cè)定
，
MTT反應(yīng)的量。
另將培養(yǎng)皿置于倒立顯微鏡下觀察型態(tài)，藉由觀察細(xì)胞
型態(tài)的變化，瞭解細(xì)胞受損的情形。正常健康的神經(jīng)元細(xì)
胞會(huì)呈現(xiàn)平滑之橢圓或圓的外型及直徑一致，外型平滑的
軸突。死亡的細(xì)胞外觀呈現(xiàn)細(xì)胞膜不完整，細(xì)胞萎縮、破
裂以及軸突斷裂的現(xiàn)象。
1小時(shí)后，將上層液體吸除，加入
第三節(jié)、資料之統(tǒng)計(jì)與分析
將實(shí)際測(cè)得之?dāng)?shù)值平均后，以平均值加減標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean
±SE）為製作圖表之依據(jù)。并使用SigmaPlot套裝軟體，進(jìn)行
17
重複變數(shù)單因子變異數(shù)分析（One-wayANOVA）來(lái)分析各組