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本文標(biāo)題："老師對(duì)于原生質(zhì)實(shí)驗(yàn)材料前準(zhǔn)備的指導(dǎo)"

老師對(duì)于原生質(zhì)實(shí)驗(yàn)材料前準(zhǔn)備的指導(dǎo)：

準(zhǔn)備時(shí)間：一小時(shí)

緩沖溶液的配製(0.625M的mannitol，500ml)

【注：藻類則為0.84M】

1.先在200ml的蒸餾水加入56.94g的mannitol，使其溶解后，再加蒸餾水直到總體積為500ml。

2.每一組先取10ml 的溶液到試管或燒杯中，或在實(shí)驗(yàn)期間提供每一組學(xué)生取10ml的總量。

Notes：

1.甘露醣醇（mannitol）是一種六碳醣類之醣醇，幫助維持原生質(zhì)體的等張滲透壓（isotonic），其百分比濃度約為12~14﹪。

2.以上所配製的mannitol溶液其pH值約為4~5，若將mannitol的pH值調(diào)為6~7時(shí)，將可獲得更多的原生質(zhì)體。（一滴0.1N的NaOH應(yīng)足夠調(diào)整50ml溶液的pH值）。

3.0.625M的蔗糖溶液可和煙草葉作用的很好，也可和Elodea及波菜葉作用。但蔗糖會(huì)被細(xì)胞代謝，所以在培養(yǎng)期間，其濃度會(huì)降低，而影響滲透壓緩沖的能力。

4.若製備原生質(zhì)體的目的，是要來(lái)做電破法或其他的轉(zhuǎn)殖技術(shù)的，則用0.6M的mannitol，25mM的MES緩沖溶液。也就是加54.66g的mannitol和2.44g的MES 到200ml的蒸餾水中，用1.0N的NaOH（約每50ml，15滴）調(diào)整pH值到5.7，然后加水至500ml，滅菌。

5.MES是一種酸鹼緩沖物質(zhì)（用來(lái)維持蛋白質(zhì)活性）。

酵素：軟化酵素（macerase）和纖維酵素（cellulysin）

    * 用稱藥紙稱0.1g軟化酵素和0.2g纖維酵素，放入每組的試管中或燒杯中。P.S這兩種酵素可以溷合在一起。

    * 在用之前立刻加酵素到10ml的緩沖溶液內(nèi)----酵素的濃度為1﹪軟化酵素和2﹪?yán)w維酵素。

Note：

1.在用之前，立刻將酵素加入緩沖溶液中，因這些酵素長(zhǎng)時(shí)間在高溫下會(huì)不穩(wěn)定。如果是在無(wú)菌臺(tái)中操作下，可先用一個(gè)注射針筒，裝新鮮配好的酵素，用0.45μ的薄膜過濾消毒之。

2.Macerase (軟化酵素)是Sigma公司的專有名稱，也就是粗果膠酵素(crude pectinase)，是Rhizopus真菌萃取而來(lái)的。果膠酵素可將細(xì)胞與細(xì)胞之間軟化而分開。

3.Cellulysin是Sigma公司的專有名稱，也就是纖維酵素（cellulase），是從Trichoderma uride 分離而來(lái)的，此種酵素可溶解細(xì)胞壁的纖維素。

老師對(duì)于實(shí)驗(yàn)大綱的陳述：（略）

下列的大綱將用轉(zhuǎn)殖的問題來(lái)當(dāng)做活動(dòng)的內(nèi)容。

1.介紹轉(zhuǎn)殖的概念（外來(lái)DNA進(jìn)入細(xì)胞的介紹）。討論為什么人要轉(zhuǎn)殖細(xì)胞的理由。（引入新的基因，而使新的性狀進(jìn)入細(xì)胞或生物體內(nèi)）。

2.要求學(xué)生描述細(xì)胞的屏障（如細(xì)胞膜、細(xì)胞壁）。討論藉由這些屏障而能維持在細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)（如水、溶質(zhì)、胞器、DNA）和思考如果這些物質(zhì)沒有在細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞的命運(yùn)將如何。討論為什么細(xì)胞可維持DNA在細(xì)胞內(nèi)（膜可維持DNA在內(nèi)，將可能同樣地會(huì)不讓DNA進(jìn)入；假如病毒的DNA或RNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，通常會(huì)破壞細(xì)胞）。

3.引導(dǎo)學(xué)生思考出不傷害細(xì)胞的轉(zhuǎn)殖方法。并請(qǐng)學(xué)生詳述每個(gè)步驟的證明方法。

4.由學(xué)生來(lái)製備原生質(zhì)體，并回答分析問題。

5.學(xué)生複習(xí)他們所提出的轉(zhuǎn)殖方法，并討論決定何者會(huì)成功。

外加的資訊：