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本文標(biāo)題："用于修飾DNA的酶與使用方法"

用于修飾DNA的酶與使用方法
酶應(yīng)保存在-20℃冷柜中, 使用時(shí)取出放在0℃冰上, 酶的價(jià)格昂貴, 宜珍惜使用.

各種酶均有其特別的緩沖液. 通常均可在採購時(shí)向廠商索取.

    The Klenow fragment：是E.Coli DNA PolymeraseI靠C端的部份，為刪去由NH2端的323個(gè)胺基酸而成，具有DNA Polymerase與3'→5'exonuclease的功能. 以Klenow fragment來將含螢光標(biāo)定的d NTP或放射性標(biāo)定的d NTP加于DNA片段尾端, 可將約0.1~4μg由電泳中提純的DNA, 加上螢光標(biāo)定的d NTP, 再加上未標(biāo)定的3 d NTPs, 再加上1U的Klenow fragment, 再加入適量buffer, 置30℃, 20min即可(其中d NTP的濃度在0.5mM). 此原理是利用限制酶切割后再經(jīng)電泳提純的DNA, 在二端均有 ----____單股部分, Klenow fragment會將d NTP加于單股處, 此時(shí)需注意的是所缺的單股若正好無可配標(biāo)定d NTP的核甘酸則無法標(biāo)定, 故應(yīng)注意. 如以Ban HI切割的會有GATC排序, 若以Eco RI切割的則會有AATT排序, 此時(shí)若以有標(biāo)定的GTP或CTP來標(biāo)定則無效.

    亦可採用Random Oligonucleotide-Primed synthesis方法來標(biāo)定DNA, 其原理為：將DNA以某一限制酶切割, 再電泳, 取出所需的DNA片段, 加熱使此雙股DNA分為單股, 再將Random Oligonucleotide(通常為六個(gè)nucleotides)接上去, 再放入d NTPs即Klenow frament, 如此, 則DNA片段就會被標(biāo)定了.

方    法：

1.     在一個(gè)小型離心管中加入2.5μl之0.5mM 3dCTPs.

2.     再加入10X之Klenow fragment buffer, 2.5μl.

3.     加入欲標(biāo)定之有標(biāo)定dNTP, 1μl.

4.     再加入1μl之Klenow fragment.

5.     再以另一支離心管, 加入約0.03~0.1μg的DNA(想被標(biāo)定的DNA), 及Random hexanucleotide(1μg), 再加入T.E. buffer使總體機(jī)為18μl, 將此離心管置沸水中3min, 再取出放冰上.

6.     將二支離心管物溷合, 置室溫, 3hr, 反應(yīng)即完成.

Taq DNA Polymerase之使用：

    此酶係由Thermus aquaticus菌所分離出來, 它的最有效溫度是在75~80℃, 它多被用于Polymerase Chain Reaction(PCR). 其使用方法在介紹PCR時(shí)再行介紹.

    RNase亦有由不同來源分離出來者, 所切割RNA的位置亦不同, 但一般RNase均能在多種反應(yīng)情況下產(chǎn)生作用, 且使用后若要除去它, 通常要加入Proteinase K, 再以Phenol extractions及ethanol precipitation處理.

DNA ligases：

    用以接合單股有缺口的DNA或雙股可交叉配合的DNA(即以限制酶切割所形成的 ----____ 交叉片段. 時(shí)下使用的ligase, 要ATP, E.Coli ligase要NAD為能源.

使用方法：

1.     在微量離心管中加入ligase緩沖液,再加入0.5mM ATP, 1μg DNA(即所需接合的DNA), 再加入1μ的T4 ligase, 置15℃, 2hr, 可成.

2.     若係二段鈍端DNA接合(即無交叉片段之DNA), 則需10倍以上的酶方能達(dá)成. 有研究顯示加入即為量的PEG8000可助ligase的功能.

運(yùn)用ligase構(gòu)建嫁接DNA分子：

1.     再將想構(gòu)建的DNA片段經(jīng)電泳幼提純之后, 以下法進(jìn)行：

2.     取0.1至5μg想接合構(gòu)建的DNA放入微量離心管中(體積以9μl為準(zhǔn)), 再加入10μl之2X ligase buffer, 再加入1μl之10mM ATP, 再加入20至500μ的T4 DNA ligase(以有交叉配對的DNA為準(zhǔn)).

3.     置15℃, 3hr, 或隔夜, 可成.

4.     將此接合之嫁接媒介, 以基因轉(zhuǎn)植方式, 植入E.Coli宿主, 并檢查結(jié)果, 依m(xù)arker表現(xiàn)情形可知有無正確的結(jié)果, 若有, 則將含此正確嫁接媒介的E.Coli加以培養(yǎng), 再以提純質(zhì)體方式獲取大量所要的嫁接媒介.

2X T4 DNA ligase buffer之配方為：

100mM Tris.Cl, pH7.5

 20Mm MgCl2

 20Mm DTT(dithiothreitol此物必須冷凍保存)

    在構(gòu)建嫁接媒介時(shí), 必須考慮到它要能在宿主中能自行複製, 且能將所要的基因表現(xiàn)出來, 而且還能加上marker, 以便由marker之有無來檢測構(gòu)建之成功與否. 在使用ligase時(shí), 常會有各種機(jī)率的結(jié)合, 而產(chǎn)生非所要的結(jié)果,亦有多段結(jié)合者， 但因皆與或然率有關(guān), 理論上仍會出現(xiàn)若干所要的結(jié)果.