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本文標(biāo)題："使用基因槍轉(zhuǎn)植基因注意事項(xiàng)有哪些？"

使用基因槍轉(zhuǎn)植基因

注意事項(xiàng)：

1.     切勿將槍口對(duì)人.

2.     事前備妥polyvinylpyrollidone(MW＝360,000,100g約750元), Spermidine(Sigma #S-0266, 5g約3,500元). 99.9﹪酒精. 15ml與1.5ml離心管, 0.05M Spermidine, 1M CaCl2, 20mg/ml polyvinylpyrollidone (溶于酒精) 使用前取少量稀釋成0.1mg/ml, 準(zhǔn)備3.5ml以供50發(fā)子彈用,

3.     每50發(fā)子彈,  用35mg金粉  (直接置入離心管測(cè)),  100μg DNA (濃度＞1μg/μl). 管子長(zhǎng)76cm. 以3.5ml液狀充填.

4.     子彈準(zhǔn)備架左方有2個(gè)小膠圈(O-rings), 及槍噴口有1個(gè)小膠圈, 用久磨損須更換.

步    驟：  (每50發(fā)子彈用)

1.     將35mg金粉(直接置入1.5ml離心管測(cè)), 加入100μl之0.05M Spermidine, vortex 5sec, sonicate 10sec.

2.     加入100μg DNA(若同時(shí)轉(zhuǎn)植1種以上基因, 等量加入), vortex 5sec.

3.     加入100μl 1M之CaCl2, 以低速vortex 5sec, 再置室溫使沉淀10min, 離心4,000rpm, 15sec, 吸除上清,

4.     加入1ml 99.9﹪酒精, 以低速vortex 5sec, 離心4,000rpm, 15sec, 吸除上清, 如此, 重覆3次, 吸除上清.

5.     加入0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 0.5ml, 以低速vortex 5sec, 將管內(nèi)物全部吸入15ml離心管中, 再以0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 1ml加入原1.5ml離心管中, 再以低速vortex 5sec, 將管內(nèi)物再全部吸入15ml離心管中, 再以0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 1ml 加入原1.5ml離心管中, 再以低速vortex 5sec, 將管內(nèi)物再全部吸入15ml離心管中, 再于15ml離心管中加入0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 1ml, 再以低速vortex此15ml離心管5sec, 此時(shí)可將此管保存于-20℃. 或接下列步驟.

6.     將子彈準(zhǔn)備架安置好, 并通入N2, 將76cm子彈管由右側(cè)插入, 直通至左側(cè)環(huán)內(nèi)1cm, 將氮?dú)忾_(kāi)關(guān)調(diào)至0.3~0.4, 并吹氣入管15min.

7.     關(guān)掉氮?dú)忾_(kāi)關(guān), 將管取出, 將一端插入接有軟接頭的10ml針筒管, 將子彈管另一端置入含3.5ml黃金粉, DNA的液體中(此液體需先以低速vortex 10sec, 兩sonicate 30sec, 并立即使用), 以針筒吸取液體至子彈管長(zhǎng)64cm處, 將子彈管取出, 但是再以針筒吸子彈管中液體, 使子彈管兩端均留下約6cm空白, 立即將子彈管插入準(zhǔn)備架, 并等5min, 使金粉粘在管壁, 再以針筒以2cm/sec的速度將子彈管中酒精吸除.

8.     取下針筒, 將準(zhǔn)備架旋轉(zhuǎn)開(kāi)關(guān)打開(kāi), 使轉(zhuǎn)動(dòng)30sec, 再打開(kāi)氮?dú)? 使子彈管乾燥5min, 關(guān)氮?dú)? 停轉(zhuǎn), 將子彈管取出.

9.     檢查子彈管, 看金粉是否均勻分佈, 將不良部份以簽字筆注記, 以便切成子彈時(shí)棄之.

10.將子彈保存盒(含乾燥劑)置切子彈器下, 將子彈管插入切子彈器, 開(kāi)始切子彈, 完成后將子彈保存盒標(biāo)示清楚, 蓋好, 并以parafilm封好, 保存于4℃. 在使用前將子彈裝入彈夾, 將彈夾以"12"向上裝至定位.

11.將氦氣接好, 調(diào)至400psi, 最大至600psi, 準(zhǔn)備射擊. 射擊后, 取下彈夾, 關(guān)氦氣總開(kāi)關(guān), 將氦氣調(diào)節(jié)閥逆時(shí)針轉(zhuǎn), 排氣, 再拆下接管.

12.若射擊動(dòng)物附著細(xì)胞, 吸除培養(yǎng)液后為之, 浮懸細(xì)胞則以5×107cells/ml濃度, 取20μl, 滴于培養(yǎng)皿上, 使分佈直徑小于1.5cm, 若射擊動(dòng)物皮層, 先剃去毛, 用70﹪酒精消毒后為之.

若要以RNA取代DNA, 則不用CaCl2, 與polyvinylpyrollidone而用5M ammonium與2-propanol來(lái)將RNA附在金粉上. 其步驟類(lèi)同處理DNA.

簡(jiǎn)述如下：

1.     量35mg金粉, 加入液體mRNA, (5μgRNA/mg金粉), 加入液體mRNA體管1/10量的5M ammonium與2倍量的2-propanol, vortex 15sec, 離心離心4,000rpm, 15sec, 吸除上清.

2.     加入1ml 99.9﹪酒精, 以低速vortex 5sec, 離心4,000rpm, 15sec, 吸除上清.

3.     加入0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 0.5ml, 以低速vortex 5sec, 將管內(nèi)物全部吸入15ml離心管中, 再以0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 1ml 加入原1.5ml離心管中, 再以低速vortex 5sec.

4.     將管內(nèi)物再全部吸入15ml離心管中, 再以0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 1ml加入原1.5ml離心管中, 再以低速vortex 5sec.

5.     將管內(nèi)物再全部吸入15ml離心管中, 再于15ml離心管中加入0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 1ml, 再以低速vortex 此15ml離心管5sec, 此時(shí)可將此管保存于-20℃. 即成.