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本文標(biāo)題："ABI 310型核酸自動排序儀做排序用說明？"
使用ABI 310型核酸自動排序儀
做排序用
說明：
1. 此儀器採雷射光偵測在毛細(xì)管電泳中, 不同顏色標(biāo)定之ddNTP核酸合成中斷法之顏色, 而以電腦軟體判讀排序. ABI 310在使用BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit時, 採E型濾光模式偵測.
2. 目前本校採購本ABI 310型核酸自動排序儀的美商應(yīng)用生命科學(xué)儀器公司有2種套組供核酸自動排序儀使用, 其一為ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, 另一為ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0. 其中v2.0用于較長段的核酸排序, 但2者的protocol 完全相同, 均可用于單股, 雙股, PCR成品等之排序之用, 採購時以v2.0為佳.
3. 上述kits中, Taq polymerase, buffer等均己溷在一起便于使用.
4. 若需軟體部份, 可由http://www.pebio.com/ab/techsupp/310.html download.
5. ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit with AmpliTaq FS v2.0, 分別有可使用100(採購編號#4303149)次, 或1,000(#4303150)次等多種. 可依用量選購, 此Kit應(yīng)保存于-20℃.
6. 在template的使用量上,參考下表:
PCR product(必須純化):
100~200bp 1~3ng
200~500bp 3~10ng
500~1000bp 5~20ng
1000~2000bp 10~40ng
>2000bp 40~100ng
Single-stranded DNA 50~100ng
Double-stranded DNA 200~500ng
Cosmid or Bacterial artificial chromosome (BAC) 0.5~1.0μg
Bacterial genomic DNA 2~3μg
7. 整個排序用樣最終體積為20μl, 包括8μl DNA template, 4μl primer, primer的濃度為0.8pmol/μl, 若將primer的濃度提高為4.2pmol/μl, 則可只用1μl, 而template則可用到11μl. 另8μl為Cycle sequencing mix.
8. 本儀器軟體均已由廠商代為裝妥, sequencing data collection于電腦開機(jī)即可使用, 在分析時則另以分析軟體行之. 有需校對儀器時, 可用ABI 310 diagnostics system軟體, 對整個儀器校對約需9min. 排序完成后, 可用Factura Identification Software整理結(jié)果.
執(zhí)行plasmids 與PCR products的sequencing步驟：
先執(zhí)行Cycle sequencing, 在本校的RoboCycler 40型thermal cycler執(zhí)行. 用0.5ml的離心管, 加入：
Terminator Ready Reaction Mix 8.0μl
Template 如說明5
Primer如說明6
上3項合計20μl,若不足,加去離子水.
1. 充分溷合后, 離心3,000rpm, 5sec, 再加40μl mineral oil.
2. 然后進(jìn)行反應(yīng)96℃ 30sec, 50℃ 15sec, 60℃ 4min, 25cycles. 然后取出, 離心3000rpm, 5sec.
3. 再進(jìn)行純化(使用Bio-Rad Quantum Prep PCR Kleen Spin Columns –步驟為先將column中的resin緩速vortex 10sec, 將底部帽取下, 將column置入1支2.0ml離心管中, 離心750xg, 1min, 再將column置入1支1.5ml已高溫高壓消毒過的離心管, 將要純化的DNA吸入管中, 離心750xg, 2min, (速度不可太高, 時間不可超過2min) 所得即為純化DNA).
※有關(guān)xg換算為rpm的參考公式如下：
xg＝1.12×105×r
(r為由軸心至離心管正中間之半徑cm值×rpm2)
或
xg＝11.18×r×(rpm/1000)2
若為BAC DNA,則用0.5ml的離心管,加入
Terminator Ready Reaction Mix 16.0μl
Template 如說明5
Primer 5~10 pmol
上3項合計40μl, 若不足, 加去離子水.
1. 充分溷合后, 離心3,000rpm, 5sec, 再加40μl mineral oil. 然后進(jìn)行反應(yīng)25 cycles.
2. 然后取出, 離心3000rpm, 5sec.
3. 再進(jìn)行純化.
若為Bacterial Genomic DNA, 則用0.5ml的離心管, 加入：
Terminator Ready Reaction Mix 16.0μl
Template 如說明5
Primer 6-13 pmol
上3項合計40μl, 若不足, 加去離子水.
1. 充分溷合后, 離心3000rpm, 5sec, 再加40μl mineral oil.
2. 然后進(jìn)行反應(yīng)25 cycles. 取出, 離心3000rpm, 5sec.
3. 再進(jìn)行純化.
※若無Quantum Prep PCR Kleen Spin Columns,可採沉淀純化法:
(1). 將PCR的結(jié)果吸入一支1.5ml離心管, 儘量不沾mineral oil.
(2). 再加入80μl 75﹪isopropanol, 緩速vortex 10sec, 置室溫15min, 離心13,000rpm, 20min, 將上清液吸除.
(3). 加入250μl 75﹪isopropanol, 緩速vortex 10sec, 離心13,000rpm, 5min, 將上清液吸除.
(4). 將管蓋打開, 置heat block上90℃, 1min, 使乾燥.
※亦可採用酒精沉淀法：
(1). 將PCR的結(jié)果吸入一支1.5ml離心管, 儘量不沾mineral oil.
(2). 再加入16μl去離子水, 64μl 95﹪ethanol, 緩速vortex 10sec, 置室溫15min, 離心13,000rpm, 20min, 將上清液吸除.
(3). 加入250μl 70﹪ethanol, 緩速vortex 10sec, 離心13000rpm, 5min, 將上清液吸除.
(4). 將管蓋打開, 置heat block上90℃, 1min, 使乾燥.
※亦可採用酒精與醋酸鈉沉淀法：
(1). 將PCR的結(jié)果吸入一支1.5ml離心管, 儘量不沾mineral oil.
(2). 再加入2μl的3M sodium acetate, 50μl 95﹪ethanol, 緩速vortex 10sec, 置室溫15min, 離心13000rpm, 20min, 將上清液吸除.
(3). 加入250μl 70﹪ethanol, 緩速vortex 10sec, 離心13,000rpm, 5min, 將上清液吸除.
(4). 將管蓋打開, 置heat block上90℃, 1min, 使乾燥.
使用ABI 310排序儀:
1. 將前所得樣本溶于25μl的Template Suppression Reagent(TSR)中(隨polymer提供), 緩速vortex 15sec, 離心1000rpm, 10sec, 置heat block 95℃, 2min, 并立即置冰上, 待用.
2. 要用多少樣本量與DNA模子的品質(zhì), 引子功能等均有關(guān), 但最少需要10μl. 將樣本(>10μl)吸入0.5ml管中, 蓋上塞子. 緩速vortex 15sec, 離心1,000rpm, 10sec, 置heat block 95℃, 2min, 并立即置冰上, 待用.
3. 將準(zhǔn)備好的tubes置機(jī)器之樣本管架上, 并在紙上記下每支管之樣本名及排列位置.
4. ABI 310 用performance optimized polymer 6(POP-6此6代表6﹪)做為毛細(xì)管電泳材(採購編號P/N[part number] 402844其中包括2瓶TSR). 在GeneScan時用POP-4(4﹪)(P/N 402838)及10x Genetic Analyzer Buffer with EDTA (#402824)(使用時稀釋為1x).
5. 毛細(xì)管可至少供100次樣本用, 不用時需洗淨(jìng)并將兩頭浸入deionized water中. 毛細(xì)管的窗戶部份不應(yīng)手握, 有灰可以酒精擦拭.
6. 若run 600-base, 用61cm毛細(xì)管(粉紅色注記), 用Seq POP6 E run module, 200v/cm, 約120min. 若run 400-base, 用47cm毛細(xì)管(綠色注記), 用Seq POP6 Rapid E run module , 320v/cm, 約35min. 溫度均為50oC. 以上均用1ml針管, BD set any primer. 并使用CE-1 basecaller.
7. 將pump block以自來水洗淨(jìng), 再以dH2O沖洗, 以吹風(fēng)機(jī)風(fēng)乾, 用1.0ml玻璃針筒緩緩吸0.2ml POP-6, 將針桿抽吸數(shù)次, 再緩緩吸入0.5ml POP-6, 若有氣泡必須將針筒直立待汽泡上升, 加以排出.
8. 再以蒸餾水清洗針筒外部, 并以Kimwipes擦乾, 將針裝于定位, 關(guān)緊廢料口, 并旋緊左側(cè)上方供裝塑膠針筒的Luer valve, 裝好毛細(xì)管, 毛細(xì)管左瑞正好在針筒下出口之前, 旋緊毛細(xì)管接頭, 毛細(xì)管另一端(右瑞)須超過細(xì)鐵柱0.5mm, (細(xì)鐵柱先以dH20擦淨(jìng), 擦乾). 視窗處通過laser光眼, 關(guān)好黑色蓋, 其馀部份以黃色耐熱膠布貼在白色加熱板上.
9. Turn on儀器, 由電腦中選"about collection software", 在Manual control window點(diǎn)Function pop-up menu, 再點(diǎn)autosampler present tray再點(diǎn)execute, 此時autosampler tray會退出, 將samples置于tray上, 再選Function, 點(diǎn)autosampler return tray, 再點(diǎn)execute, tray就退回定位, 即可將右側(cè)門關(guān)上. 再選Instrument視窗, 點(diǎn)Change capillary, 按reset, 使injection counter為0.
10.此時, 取13.5ml dH2O＋1.5ml 10x running buffer溷勻, 加入buffer valve chamber至紅線處, 再加入vial 1至黑線處. 將有紅線之玻璃小杯裝妥, 將vial置tray之位置1, 置另一含dH2O之vial 2于位置2, 均加上有孔蓋, 再取1去蓋1. 5ml離心管裝dH2O置位置3.
11.此時設(shè)定Syring Max Travel值, 在電腦上選Manual control window, 選Function, 再選Syring Home, 再按execute, 再選Syring Max Travel, 點(diǎn)Syring down, 按execute, 每按1次, toggle會向下一點(diǎn), 按至toggle與針桿相接即停, 再選Syring up, 輸入250值再按execute.
12.再選Buffer valve close, 按execute, 將玻璃針筒下方接頭略鬆一點(diǎn), 將針桿推一點(diǎn), 使下方接頭之白色管頭現(xiàn)出1滴polymer以去除空氣, 再將下方接頭旋緊. 再選buffer valve open, 按execute, 將針桿推一點(diǎn)使polymer充填至左側(cè)上方接頭之下近斜坡管處, 再選buffer valve close, 按execute, 再選Syring down, 按execute, 可多按幾次, 使polymer充至斜坡管內(nèi)滿為止. 再由function中選temperature, 設(shè)定為50℃, 按execute.
13.此時選Autosampler calibration, 按start, 再按ABI 310機(jī)器左側(cè)之tray鍵, 使tray移動一下, 選autosampler home x, y, axis, 再按execute, 再選autosampler Z axis, 再按execute, 再選syring home, 按execute. 關(guān)上機(jī)器所有之門.
14.由File項選new, 再選sequence sample sheet 48 tubes, 輸入sample名稱, quit此window, 再按save, 第2次再按save. 再由file, 選new, 再選sequence injection lift, 選sample sheet, 選出方才建的檔名, 再選A1-1即第1行第1格. 此時選Edit, 再選insert, 選一個名稱, 按綠色箭頭即run. 儀器自動run至結(jié)束. 若再續(xù)run, 先quit injection lift, 再save, 再選autosampler present tray 按execute, 取出舊samples, 放入新samples, 再按return tray, 再選syring home x,y,…..依前述步驟.
15.分析Data, 用sequence analysis, 選add file, 再選ABI 310, 按ABI Prism 310, 按open, 按runs, 再按open, 選所要的file, 按open, 選要分析之sample, 按add file, 再按done, 再按start, 按sample file之名, execute, 即可看結(jié)果, 再按P, 按start, 即可印出.