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本文標(biāo)題："不知道在做DAB時(shí)， 最后在染核時(shí)，是用什么染劑?"
IHC的background消不掉
: 我用的是心臟組織，目前blocking的條件是1%的PBA于室溫下一小時(shí)，
: 而且另外在一抗前，還用一個(gè)comercial的power blocking reagent做blocking，
: 至于組織本身顏色的問題，心臟組織我目前染的感覺，在螢光顯微鏡下，
: 不同濾鏡片，也會(huì)呈現(xiàn)不同顏色，
: 至于在光學(xué)顯微鏡下，我到覺得沒啥顏色就是，
: biotin的問題，其實(shí)我不太懂，但是該做的步驟我都有，
: 像是H202的quench，這方面我不熟悉，所以我不知道會(huì)不會(huì)有什么影響
做DAB呈色 用H2O2以去除內(nèi)生性的proxidase是很重要的
但是如果是做螢光染色 這各步驟可以省略
還有 可以試試看用 H2O2的步驟 最后反應(yīng)用螢光呈色
再利用Roche的 Conver-POD 就可以針對(duì) FITC的螢光在接合后
用DAB呈色
這各我以前也有玩過 至少一個(gè)片子 可以看到兩種效果
(不過 只可針對(duì)用FITC的)
: 另外，antigen unmasking我是有做的，我是以10mM的sodium citrate，
: 以隔水加熱法，于沸水中作用20分鐘，
Sodium citrate我習(xí)慣用 fresh的 (還得要調(diào)pH值)
不過因?yàn)槲叶际亲隼鋬銮衅?nbsp; 這各步驟就不一定要做
: 不過冷卻的動(dòng)作我倒是挺隨性，煮完我就直接泡在PBS了，不知道這樣會(huì)不會(huì)有影響
: 過染的問題，我比較好奇的是，各位前輩在做DAB染色時(shí)，
: 當(dāng)加入DAB reagent后，都可以在30秒內(nèi)，
: 整個(gè)組織切片，會(huì)用肉眼就可以看到明顯的變成紅褐色嗎？
: 因?yàn)槲夷壳坝羞@樣的狀況。
: 抱歉，敘述的不是很好，不知道在做DAB時(shí)， 最后在染核時(shí)，是用什么染劑，
: 以及染完后，是否整個(gè)組織顏色都會(huì)變成此染劑的背景色
: 謝謝各位喔 m(_ _)m
有時(shí)候DAB染的過度 會(huì)造成很強(qiáng)的背景
所以 當(dāng)在做DAB反應(yīng)的時(shí)候
可以準(zhǔn)備一臺(tái)顯微鏡 將確定會(huì)有反應(yīng)的片子
或是有做 postive control的片子
滴上DAB反應(yīng)劑 觀測看看 預(yù)期可能反應(yīng)的細(xì)胞 或 組織
是否有反應(yīng)的細(xì)胞 終止反應(yīng)就將片子放在TBS中(or PBS)
通常我都是以觀察大約數(shù)片 之后決定所有片子的反應(yīng)時(shí)間
最短的 30秒都有可能 而且老師很挑剔的要看到
背景乾乾淨(jìng)淨(jìng) 細(xì)胞反應(yīng)很明顯的對(duì)比
之后如果再做對(duì)比染色就相對(duì)的比較容易做出差異性的區(qū)別
再退染時(shí) 我也都會(huì)用顯微鏡觀察
是否有達(dá)到我要看到核有染上色 但細(xì)胞質(zhì)沒有 (酒精退色的時(shí)候要注意看)
最好是細(xì)胞核就深深的藍(lán)色 而細(xì)胞質(zhì)是透明的
雖然說起來很簡單 但是 我知道 會(huì)手忙腳亂
因?yàn)槲乙婚_始常常就是把片子染DAB 老闆對(duì)著我說
"妳的組織切片 是被妳用火燒過嗎?!"
再來是對(duì)比染色時(shí) 老闆會(huì)說 妳是染細(xì)胞核還是整各細(xì)胞質(zhì)啊?!
此外 在不同組織塊 得要挑選適合的染劑作對(duì)比染色
像 brain 用 Hematoxylin 很不容易染上色
可換用 Nissl stain 會(huì)很明顯的看到neuron 的細(xì)胞核
不過 大部分採用 Hematoxylin 即可
如果方便可以提供你是用哪種組織及blocking的條件,會(huì)比較 12/27
容易找問題,或許有些人有類似的經(jīng)驗(yàn)
background可能來自組織本身的biotin,此時(shí)就要從blocking著手
你的組織本身就有顏色嗎? 會(huì)不會(huì)是過染了?
如果是過染 把一抗的比例調(diào)低試試
你有做antigen unmasking嗎?