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本文標(biāo)題："組織切片顯微鏡觀察的技巧？顯微鏡小知識！"

石蠟切片觀察
目的  學(xué)習(xí)組織切片觀察的技巧
原理  石蠟切片的原理是將樣本的組織灌入石蠟,使得其質(zhì)地像石蠟一般(想想化石形成的原理),才能既而將其切成約10μm的薄片而不損壞樣本的構(gòu)造形狀。樣本應(yīng)依序經(jīng)由
1)固定.
2)脫水
3)包埋.
4)切片.
5)染色及
6)封片
等步驟製作成可觀察及保存的玻片標(biāo)本.
材料  美國螯蝦1公分的幼蝦(或其他沒有過硬外骨骼之小樣本皆可)
設(shè)備  rotary microtome(迴旋式切片機(jī))
water bath(水浴槽)
hotplate(加熱板)
light microscope(光學(xué)顯微鏡)
真空抽氣機(jī)(可定溫)
石蠟填充機(jī)
數(shù)位相機(jī)
電腦及影響編輯軟體
slide, coverslip
染缸若干
玻片架若干
藥品  Mayer's glycerol albumen(蛋白膠)
Xylene(histosol)(清洗劑－脫酒精，使組織透明化)
70%,80%,95%,100% alcohol(脫水劑)
Eosin
Mayers haematoyline
synthetic mount(封片膠)
石蠟
步驟  1. 固定: 在實(shí)驗(yàn)開始前1-3天將活的標(biāo)本浸泡于福馬林(formalin)中固定，若樣本有外骨骼，體積又相對的較大(1cm)時(shí)可以細(xì)解剖刀片在其表面劃幾刀使福馬林較易滲入。
2. 脫水: 依序由低濃度到高濃度(最后為100%)的酒精漸進(jìn)脫水
70% alcohol 1.5hr
80% alcohol 1hr
95% alcohol 1hr
95% alcohol 1hr
100% alcohol 1hr
100% alcohol 1.5hr
histosol 1.5hr for dealcoholization
histosol 1.5hr
3. 包埋: 將樣本置于樣本皿中間底部，填充石蠟(石蠟填充機(jī)要先預(yù)熱使石蠟融化),真空抽氣使石蠟滲入組織(65℃)，之后由65℃真空抽氣機(jī)中取出后靜置待其自然冷卻。
wax (with vacuum) 1.5hr
再填一次wax(with vaccuum) 1.5hr
4. 切片:將樣本周圍多出的蠟塊以單面刀片修去，修成合適的梯形。將樣本卡于切片機(jī)的樣本放置處，設(shè)定好角度使梯形的上下邊與刀片平行，并使突出的面恰與刀片相接。安置好樣本后，調(diào)整切片機(jī)刀片的角度(約10度)及切片厚度(約10μm)，轉(zhuǎn)動把手切片，使切片成帶狀且不捲曲(若不能則再檢查刀片，角度等因素作適度調(diào)整)，用水彩筆輕挑至溫水(45℃水浴槽)中展蠟,用事先準(zhǔn)備好之沾有蛋白膠之玻片(需確定玻片上的蛋白膠已夠乾之后樣本才不會在染色過程中脫落)撈起蠟片并烘乾(45℃加熱板)
5. 染色: 將沾有樣本的玻片排列于鐵架中，依下列順序經(jīng)各染色缸中染色。注意回水及脫水的程序及染色時(shí)間，可嘗試不同的染色時(shí)間已得到最好的效果:
xylene 15min
xylene 15min
100%alcohol 6dips 以下四步為脫蠟回水步驟
95%alcohol 6dips
80%alcohol 6dips
70%alcohol 6dips
water 15min
Mayers haematoyline 約10min　以下三步為染色步驟
Water 10min
Eosin 6dips
70%alcohol 6dips
80%alcohol 6dips
95%alcohol 6dips
95%alcohol 6dips
100%alcohol 6dips
100%alcohol 6dips
xylene 10min 脫酒精
xylene 10min
6. 觀察顏色是否適當(dāng),是的話用封片膠封片,注意避免產(chǎn)生氣泡
7. 將欲觀察的部位在光學(xué)顯微鏡下以數(shù)位相機(jī)拍照，再用影像編輯軟體組合，紀(jì)錄。
時(shí)間  樣本準(zhǔn)備1-3天，脫水1天，切片＋染色＋封片觀察約3hr
備注  通常樣本的準(zhǔn)備(1)-(2)需要1-3天