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本文標(biāo)題："探針濃度2 ng/μL明顯不足，而無法得到最強(qiáng)的螢光"

以多聚甲醛與酒精兩種固定劑對(duì)E. coli (G-)、Bacillus subtilis (G+)的固定效果實(shí)驗(yàn)中，由顯微鏡觀察后發(fā)現(xiàn)以酒精固定的部分經(jīng)過打散之后，細(xì)胞受到較嚴(yán)重的傷害，而導(dǎo)致細(xì)胞的雜交螢光也相對(duì)減弱。因此，在液體雜交方面無論是固定劑對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)之完整性或其對(duì)螢光強(qiáng)度的影響，多聚甲醛的固定效果皆比酒精為佳。

          于SDS濃度的最佳化分析中，在E. coli方面，最佳濃度為0.05 %，而在低濃度0.01 % 時(shí)，推測(cè)因?yàn)闈舛冗^低導(dǎo)致細(xì)胞的穿透性不佳，探針無法順利的完全進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行雜交；而推測(cè)0.5 % SDS使探針螢光減弱的原因有兩個(gè)，一為此高濃度的SDS在數(shù)小時(shí)的雜交過程當(dāng)中將細(xì)胞壁給部分溶解(lysis)，使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)(包含RNA)有外滲的現(xiàn)象；其次為SDS不僅為一種介面活性劑，也是一種核酸變性劑，當(dāng)濃度太高時(shí)會(huì)改變雜交條件的嚴(yán)格度，使探針不容易與目標(biāo)rRNA雜交上所致。在B. subtilis方面，SDS濃度的影響并不明顯，推論兩者不相同的原因?yàn)椋篍. coli是屬于革蘭氏陰性菌，其細(xì)胞壁含有大量的脂質(zhì)，這些脂質(zhì)較易受SDS的影響而分解，進(jìn)而增加了細(xì)胞的穿透性；而B. subtilis屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)含有大量的呔聚醣(peptidoglycan)，且?guī)缀醪缓�脂質(zhì)，這些由多層 peptidoglycan所連接而成的網(wǎng)狀組織構(gòu)成了厚且堅(jiān)硬的細(xì)胞壁而不易受SDS的影響。
        

 在探針濃度之實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：
1. 在所控制的菌量下，探針濃度2 ng/μL明顯不足，而無法得到最強(qiáng)的螢光。
2. 探針濃度由3 增加至10 ng/μL所獲得的平均螢光強(qiáng)度已不再明顯提升，最佳之探針濃度應(yīng)在3 ~ 5 ng/μL之間。
3. 加入高濃度的探針 (5 ng/μL以上) 并無法有效提高螢光強(qiáng)度，在螢光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)反而會(huì)提高探針非專一性鍵結(jié)的機(jī)會(huì)。
         

在pH值對(duì)fluorescein螢光強(qiáng)度的影響實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)雜交步驟完成之后細(xì)菌懸浮液之pH為7.2時(shí)螢光強(qiáng)度明顯弱于pH值8.4時(shí)，因此液體雜合之保存液PBS的pH值應(yīng)調(diào)整為8~9之間。
          活性污泥中含有許多非細(xì)胞之顆粒雜質(zhì)，使用Flow Cytometry分析時(shí)也都會(huì)被一一的偵測(cè)到，產(chǎn)生出巨大的背景雜訊，本實(shí)驗(yàn)成功測(cè)試出最佳之PI (會(huì)與雙股DNA或RNA結(jié)合之核酸染劑 )濃度，可于單雷射光源(488 nm)之Flow Cytometry分析時(shí)對(duì)活性污泥中的細(xì)胞進(jìn)行篩選，將其從雜質(zhì)顆粒區(qū)分出來，并利用FISH結(jié)合PI染色之雙重染色法進(jìn)行活性污泥族群結(jié)構(gòu)之分析。
         
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