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本文標(biāo)題："DNA定序步驟和DNA 的制備-雙去氧核醣核酸終止法反應(yīng)"

新聞來源：未知 發(fā)布時(shí)間：2012-5-27 1:42:54　本站主頁(yè)地址：http://www.y7853.cn

DNA 定序
第一部份變性雙股 DNA 的制備

取 2g 的雙股 DNA ，加去離子水至 18ul 后，加入2l denature solution(2N NaOH and 2mM EDTA) ，至于室溫5分鐘，加入2l2M ammonium acetate 和75l 70% 酒精，置于冰上 10 分鐘。再以10000rpm ，離心 10 分鐘，去除上清液。以 70% 酒精清洗一次。真空乾燥之后，以6l 去離子水溶解。

第二部份雙去氧核醣核酸終止法反應(yīng)

將第一部份所進(jìn)行完成的反應(yīng)，加入2l sequencing primer (5 pmol) 和2l sequencing buffer，置于 37℃ 15 分鐘后，加入1l DTT，2ul 1X labelling mixture, 1l(a -35S)dATP 及2l(稀釋 1:8)sequenase ，置于室溫 5 分鐘。 5 分鐘后，取 3.5l 分別加至以先預(yù)熱37℃， 2.5l 的 ddATP ， ddTTP ， ddCTP和ddGTP的管中，均勻混和后，置于 37℃反應(yīng)5分鐘后，各加入4l 的 stop solution 終止反應(yīng)，置于 -20℃ 保存至凝膠電泳進(jìn)行時(shí)。

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