真菌培養(yǎng)實驗步驟主要是？顯微鏡價格

實驗步驟 :

A.真菌之培養(yǎng)

1.利用silicone stopper (00號)先鉆孔，再塞脂棉，以作為 2ml microfuge tube 之真菌好氣培養(yǎng)之用途。

2.取2ml microfuge tube，加入0.5 ml 之YM broth，塞緊上述之silicone stopper。

3.置放于試管架以autoclave (121℃ / 15 min.)滅菌15分鐘，并以非常緩慢的方式排氣，以防silicone stopper彈開。

4.冷卻后，在無菌操作臺以接種鉺由保存之菌種( Aspergillus oryzae)接入分生孢子，塞緊后以28℃培養(yǎng)3~5天。

B.真菌Genomic DNA之分離

1.取出silicone stopper 放入75%之酒精溶液殺菌，蓋緊 2ml microfuge tube 本身之蓋子，之后

(1).以Vortex 振盪或用Tip將管壁上的菌絲撥離，再利用離心機(10000 rpm) 離心3分鐘；

(2).用 micropippet 吸取1 ml 的上清液并將之舍去不要，之后加入 1 ml 無菌水，經(jīng)Vortex 振盪后再利用離心機(10,000 rpm) 離心3分鐘；

(3).步驟同1-(2)，即用 micropippet 吸取1 ml 的上清液并將之舍去不要，之后加入 1 ml 無菌水，經(jīng)Vortex 振盪后再利用離心機(10,000 rpm) 離心3分鐘。

2.離心后，倒除上清液，放進(jìn)一支已滅過菌的研磨棒稍作攪拌，來把菌絲團分散，手戴棉手套(以防止凍傷)，之后把菌絲團連同 2ml microfuge tube 以鑷子挾住放入液態(tài)氮中作菌絲凍結(jié)，取出后，轉(zhuǎn)動研磨棒來研磨菌體。

3.取出研磨棒后，于microfuge tube內(nèi)加入400μL AP1 buffer 及 1μL RNase A solution，把microfuge tube的蓋子蓋上后，用Vortex 振盪后，把microfuge tube插進(jìn)有孔洞的保麗龍板上，再將插有microfuge tube的保麗龍板置于65℃的水浴中，保持15分鐘，而其中每2-3分鐘要將microfuge tube拿出稍作搖盪(可用手指彈)，要注意的是，在每2~3分鐘將tube拿出稍作搖盪所花費時間要扣除，即不能算在15分鐘內(nèi)→ 此步驟是為了將細(xì)胞及細(xì)胞核水解掉,以釋出DNA。(注意！在15分鐘的等待過程中，可以拿盒子去制冰機那兒盛裝一些碎冰，因為下一步驟4馬上要作冰浴的動作。當(dāng)?shù)?步驟結(jié)束后，可先將第10步驟中所需的AE buffer 放入65℃的水浴中加熱保溫)。

4.將microfuge tube從65℃的水浴中取出后，加入130μL AP2 buffer，把microfuge tube的蓋子蓋上，稍作上下?lián)u晃混合后，利用剛剛盛裝的碎冰作冰浴的動作，需保持冷卻5分鐘。

5.將混合的液體倒進(jìn)過濾管(shredder column)中(因為在此我們采用的是QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit中的column，而這一類的column是裝在2 ml collection tube內(nèi)的，即column與collection tube是一套的)，用離心機(10,000 rpm)離心2分鐘。即經(jīng)過column流出的濾液是裝盛在下面的collection tube中。

6.離心后，取出過濾管(置滅菌袋)，并將濾出在 2 ml collection tube的濾液中吸取340μL 至一個新的1.5 ml microfuge tube，之后加入170 μL AP3 buffer 及340 μL 95%酒精 (注意：酒精與AP3 buffer的比例要 2:1，而加入95%酒精是為了讓DNA沉淀)，并用吸管上下吸取作混合(此時混合的體積共有原來340μL 的濾液 + 170 μL AP3 buffer + 340 μL 95%酒精 = 850μL 的混合濾液)。

7.將850μL 的混合濾液以spin column分二階段進(jìn)行DNA吸附：

(1).將microfuge tube內(nèi)混合的濾液先吸出650μL 至spin column中(這里的spin column也與一2 ml collection tube成套的，即spin column是裝在2 ml collection tube中)，用離心機(10,000 rpm)離心1分鐘。將離心后濾出在 collection tube的濾液丟棄 (但是此時還不要把collection tube丟掉)；另外，注意千萬不要也把spin column丟掉，因為我們要的東西是吸附在spin column上。

(2).再取出步驟6 microfuge tube內(nèi)剩馀的混合濾液約200μL (即850μL 混合的濾液 –之前吸出的650μL濾液= 200μL 濾液) 倒進(jìn)原來步驟7-(1)的spin column 中，之后用離心機(10,000 rpm)離心1分鐘。我們要的東西是吸附在spin column上。

8.將流出的濾液連同collection tube一起倒掉，之后將spin column 裝進(jìn)一新的2 ml collection tube中，加入500 μL AW buffer，再用離心機(10,000 rpm)離心2分鐘。

9.倒掉濾液(但是collection tube本身不要丟棄)，再于spin column中加入500μL AW buffer，再用離心機(10,000 rpm)離心2分鐘。取出spin column (而此時可將collection tube丟掉)。

10.將spin column再裝進(jìn)另一新的1.5 ml microfuge tube中，之后加入50μL 事先于65℃保溫的AE buffer (為了要溶解原先吸附在spin column上的DNA)，把蓋子蓋上后，繼續(xù)在65 ℃中保溫5分鐘，再利用離心機(10,000 rpm)離心1分鐘。如此即可在microfuge tube內(nèi)得到DNA，再將DNA放置 -25℃ 以下的溫度作保存。