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本文標(biāo)題："蔗糖梯度離心質(zhì)體分離技術(shù)與電子顯微鏡觀察"
新聞來源：未知 發(fā)布時間：2012-12-11 23:16:53 本站主頁地址：http://www.y7853.cn
植物生物技術(shù)與食品
第一節(jié) 植物組織培養(yǎng)與基因轉(zhuǎn)殖
植物體應(yīng)處于一種具分裂能力且易于操作的狀態(tài)下，使轉(zhuǎn)殖基因能藉細(xì)胞分裂再分配到其他細(xì)胞中，因此首先必須瞭解植物的再生能力如何應(yīng)用在組織培養(yǎng)及基因轉(zhuǎn)殖。
植物于幼年期或成熟期，于莖干頂端、莖葉交接處、根部尖端之分裂組織(meristem)、甚至葉片中，可進行光合作用之細(xì)胞依然保有分裂與分化之能力。
植物再生技術(shù)即以植物細(xì)胞之分裂與分化能力為基礎(chǔ)，配合含無機鹽類、維生素、醣類與植物激素之組織培養(yǎng)基來執(zhí)行。
對植物基因轉(zhuǎn)殖工作而言，小塊的植物組織或去除細(xì)胞壁的原生質(zhì)體易于轉(zhuǎn)殖實驗操作，且植物組織培養(yǎng)本身即有純化及量產(chǎn)的目標(biāo)，故利用植物再生能力建立的組織培養(yǎng)是藉基因轉(zhuǎn)殖大量生產(chǎn)新種植物的重要基礎(chǔ)。
第二節(jié) 載體媒介基因轉(zhuǎn)殖技術(shù)
成功的基因轉(zhuǎn)殖必須先使外源DNA進入細(xì)胞中，且插入基因體內(nèi)并穩(wěn)定的進行表現(xiàn)產(chǎn)生RNA及蛋白質(zhì)。良好的載體不但可以攜帶欲轉(zhuǎn)殖之DNA片段，還可使此DNA片段插入被轉(zhuǎn)殖宿主之基因體中，并且使外源DNA發(fā)揮功能。
帶有一個特殊質(zhì)體的農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)已被證實可達成上述要求，因此這種會引起植物腫瘤的細(xì)菌經(jīng)過質(zhì)體修飾后，便成為目前最普遍使用的植物基因轉(zhuǎn)殖媒介。
農(nóng)桿菌做為植物基因轉(zhuǎn)殖媒介之基礎(chǔ)研究
農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)殖
以含雙載體之農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)殖標(biāo)的基因
基因轉(zhuǎn)殖效果之確認(rèn)
農(nóng)桿菌做為植物基因轉(zhuǎn)殖媒介之基礎(chǔ)研究
Ti質(zhì)體
藉由蔗糖梯度離心質(zhì)體分離技術(shù)與電子顯微鏡觀察，證實有一大型質(zhì)體存在于農(nóng)桿菌中。此一200~800 kb之大型質(zhì)體因可引起腫瘤，故稱為Ti質(zhì)體。
T-DNA
vir基因
T-DNA
農(nóng)桿菌感染時僅轉(zhuǎn)移一部分Ti質(zhì)體至植物細(xì)胞基因體中，后來被轉(zhuǎn)移之Ti質(zhì)體片段被稱為T-DNA，T-DNA系Ti質(zhì)體上之一段單股序列。
vir基因
除了T-DNA外，Ti質(zhì)體上另有一組vir（virulence，即代表致病性）基因，也與農(nóng)桿菌之植物致病性極有關(guān)聯(lián)。vir基因分為virA~H，virD基因所表現(xiàn)之virD蛋白負(fù)責(zé)辨識并切割T-DNA。
農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)殖
雙載體系統(tǒng)為目前在農(nóng)桿菌植物基因轉(zhuǎn)殖時最常用的，此系統(tǒng)系將Ti質(zhì)體進行剪裁修飾后獲得。
Ti質(zhì)體載體
載體一同時帶有大腸菌與農(nóng)桿菌之DNA複制起始點，大部分T-DNA區(qū)域已移除，只�？杀籿irD蛋白辨識之LB與RB序列，利用T-DNA移除區(qū)域接上標(biāo)的基因與一篩選用之標(biāo)識基因。載體二上之virD基因產(chǎn)生virD蛋白，切割LB與RB序列將其中所含之DNA轉(zhuǎn)殖入植物基因體中。
圖4-2 以Ti質(zhì)體上之T-DNA 區(qū)域構(gòu)筑標(biāo)的與報導(dǎo)基因表現(xiàn)組之二例
基因轉(zhuǎn)殖效果之確認(rèn)
基因轉(zhuǎn)殖后期工作為確認(rèn)標(biāo)的基因已穩(wěn)定的插入植物基因體DNA內(nèi)，并且外來基因可隨著生殖作用傳遞到子代中，在實驗上可抽取轉(zhuǎn)殖株之總體DNA (total DNA)，以根據(jù)標(biāo)的基因序列設(shè)計之PCR引子偵測其中是否含有標(biāo)的基因。當(dāng)證實標(biāo)的基因已插入植物基因體內(nèi)后，還可利用免疫分析法配合蛋白質(zhì)活性測試，檢測標(biāo)的基因是否已表現(xiàn)出具有生物活性的蛋白質(zhì)。
第三節(jié) 非載體媒介基因轉(zhuǎn)殖技術(shù)
微粒子撞擊轉(zhuǎn)殖法
電穿孔轉(zhuǎn)殖法
微粒子撞擊轉(zhuǎn)殖法
在轉(zhuǎn)殖技術(shù)上，標(biāo)的基因也可以物理方式直接送入植物細(xì)胞中，而微粒子撞擊(microprojectile bombardment)或稱粒子槍是最常用來取代農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)殖法之直接轉(zhuǎn)殖法。
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