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本文標(biāo)題："熒光強(qiáng)度的細(xì)胞分析用圖像熒光顯微鏡"
新聞來(lái)源：未知 發(fā)布時(shí)間：2014-7-5 0:58:44 本站主頁(yè)地址：http://www.y7853.cn
熒光強(qiáng)度的細(xì)胞分析用圖像熒光顯微鏡
對(duì)大多數(shù)希望追蹤一個(gè)特定蛋白質(zhì)的研究者來(lái)說(shuō)，使用FP需要將日的基因的
cDNA與FP構(gòu)建成融合蛋白載體然后轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞或整個(gè)生物體中。與幾平
所有的GFP變體和珊瑚來(lái)源的FP相比.EGFP作為融合蛋白效果最好。因此如果可
能的話，應(yīng)對(duì)GFP(或者其他良好的衍生物如Emerald)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。在使用其他光
譜區(qū)的FP之前，首先利用GFP優(yōu)化載體策略，從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看往往證明這是值得的。在
最好的情況下，新的GFP嵌合體及其他光譜區(qū)的衍生變體能使目標(biāo)蛋白行使正常細(xì)胞
功能，同時(shí)FP作為標(biāo)記探針報(bào)告蛋白結(jié)合位置。然而，這并不總是那么簡(jiǎn)單，研究人
員往往懷疑采用不同的FP融合載體策略是否能產(chǎn)生更好的效果。
似設(shè)宿主細(xì)胞是健康的，轉(zhuǎn)染過(guò)程不會(huì)產(chǎn)生太多的創(chuàng)傷，那么FP工作中遇到的最
常見(jiàn)的問(wèn)題是熒光信號(hào)太弱、聚集化、錯(cuò)誤定位、融合蛋白無(wú)功能以及預(yù)期的熒光強(qiáng)
度被抑制。如果這些問(wèn)題可以得到解決，研究者必須選擇瞬時(shí)表達(dá)還是穩(wěn)定表達(dá)，瞬
時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)水平差異很大。而穩(wěn)定表達(dá)需采取更多的時(shí)間來(lái)選擇穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)
胞群，但往往會(huì)產(chǎn)生更好的效果。通常首先考慮(并且更快)用組成性啟動(dòng)子瞬時(shí)表
達(dá)FP融合蛋白，然后選擇低水平熒光強(qiáng)度的細(xì)胞，這些細(xì)胞的表達(dá)水平可能接近內(nèi)源
狀態(tài)而不影響細(xì)胞的正常功能。
然而構(gòu)建穩(wěn)定的細(xì)胞系能定見(jiàn)比較融合蛋白與
對(duì)應(yīng)的內(nèi)源蛋白的表達(dá)水平，是更安全的途徑�；蛘咭部赏ㄟ^(guò)誘導(dǎo)啟動(dòng)子來(lái)構(gòu)建融合
表達(dá)載體能控制月的蛋自的表達(dá)水平。對(duì)于許多樣品來(lái)說(shuō)，可以在內(nèi)源墓因插人FP,
構(gòu)建插人內(nèi)源表達(dá)的FP標(biāo)記，這種方法在模式生物，如醉毋、線蟲和小鼠中的應(yīng)用越
來(lái)越廣泛，而幾是定量生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的最好方法。
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