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當FP強度很低或者表達水平必須控制在最低水平,就需
要考慮高效率CCD相機。如果時間分辨率非常重要,那么電
子倍增CCD 可以提供有效的解決辦法,雖然這種辦法很昂貴。
最后在PMT 技術(shù)中的突破,已經(jīng)大大提高了激光掃描共
聚焦顯微鏡的檢測效率,使用原系統(tǒng)很難做的實驗現(xiàn)在可以
用新型共聚焦顯微鏡輕易完成,
雖然以上討論了一些活細胞成像需考慮的要點,但最終
結(jié)果的好壞還要歸結(jié)到信噪比。
不帶光譜檢測的多色成像應(yīng)用濾光片組進行熒光多色成
像需要重點考慮濾光片的交叉干擾,濾光片干擾意味著一個
FP的熒光信號溢出到另一個信號通道中。
這種干擾既可發(fā)生于FP的激發(fā)也可發(fā)生于發(fā)射。兩個或
更多熒光團之間的激發(fā)干擾作用于光譜的藍光部分,而發(fā)射
干擾作用于光譜的紅光部分。例如,GFP 通�?梢酝ㄟ^紅光
發(fā)射濾光片檢測到,而紅色熒光蛋白通常不能通過綠色濾光
片檢測到。
由于這種原因,多色成像時首先使用不產(chǎn)生短波干擾的
激發(fā)光對遠紅外熒光蛋白進行成像。例如,用共聚焦顯微鏡
多線氬激光對EYFP和EGFP在同一細胞成像時EYFP首先用超EGFP
吸收值的514nm 激發(fā),然后用530-550nm 波段濾光片收集發(fā)
射光,發(fā)射濾光片不是很關(guān)鍵,因為在這里只有EYFP被激發(fā),
第二次掃描用于成像EGFP. 這里使用458nm 或477nm 氬激光
線激發(fā),然后用非常窄的490-900nm 發(fā)射濾光片成像,這種
濾光片可以精確地排除EYFP熒光而吸抓取EGFP的特定光學(xué)信
號,雖然488nm 氬激光接近EGFP的最大激發(fā)值,但是它非常
接近發(fā)射濾光片通帶,硨所收集的影像有激光干擾。
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