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本文標題："載體分子中最好具有兩個以上容易檢測的標記"
新聞來源：未知 發(fā)布時間：2017-2-26 0:39:15 本站主頁地址：http://www.y7853.cn
載體分子中最好具有兩個以上容易檢測的標記
DNA的克隆是指在體外將含有目的基因或其他有意義的DNA片段與能
夠自我復(fù)制的載體DNA連接，然后將其轉(zhuǎn)入宿主細胞或受體生物使
其增殖或進行表達的分子操作過程，因此DNA克隆又稱分子克隆、
基因操作或重組DNA技術(shù)。DNA克隆涉及一系列的分子生物學(xué)技術(shù)，
如目的DNA片段的獲得、載體的選擇、各種工具酶的使用、體外重
組、導(dǎo)人宿主細胞技術(shù)和重組子篩選技術(shù)等。
一、目的DNA片段的獲得
DNA克隆的第一步是獲得包含目的基因在內(nèi)的一群DNA分子，這
些DNA分子或來自目的生物基因組DNA或來自目的細胞mRNA反轉(zhuǎn)錄合
成的雙鏈cDNA分子。由于基因組DNA太大，不能夠完整克隆，因此
必須將其處理成適合克隆的DNA小片段，常用的方法有機械物理切
割和限制性內(nèi)切核酸酶消化。若基因序列已知而且比較小就可以人
工直接化學(xué)合成。如果基因的兩端部分序列已知，根據(jù)已知序列設(shè)
計引物，從基因組DNA或cDNA中通過PCR或RT-PCR技術(shù)就可以獲得目
的基因。
二、載體的選擇
基因工程的載體應(yīng)具有一些基本的性質(zhì)。①在宿主細胞中有獨
立的復(fù)制和表達能力，這樣才能使外源重組的DNA片段得以擴增。
②分子質(zhì)量盡可能小，以利于在宿主細胞中有較多的拷貝，便于結(jié)
合更大的外源DNA片段。同時在實驗操作中也不易被機械剪切而破
壞。③載體分子中最好具有兩個以上容易檢測的遺傳標記(如抗藥
性標記基因)，以賦予宿主細胞不同的表型特征(如對抗生素的抗性
)。④載體本身最好具有盡可能多的限制性內(nèi)切核酸酶單一切點，
為避開外源DNA序列中限制性內(nèi)切核酸酶位點的干擾提供更大的選
擇范圍。若載體上的單一酶切位點位于檢測表型的標記基因之內(nèi)可
造成插人失活效應(yīng)，則更有利于重組子的篩選。 ，
DNA克隆常用的載體有：質(zhì)粒(plasmid)載體、噬菌體(phage)
載體、柯斯質(zhì)粒(cosmid)載體、單鏈DNA噬菌體(ssDNA phage)載體
、噬粒(phagemid)載體及酵母人工染色體(YAC)等。從總體上講，
根據(jù)載體的使用目的，載體可以分為克隆載體、表達載體、測序載
體、穿梭載體等。
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