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本文標(biāo)題："含有編碼熒光蛋白DNA的質(zhì)粒檢測(cè)電子顯微鏡"
新聞來(lái)源：未知 發(fā)布時(shí)間：2017-3-13 1:06:44 本站主頁(yè)地址：http://www.y7853.cn
含有編碼熒光蛋白DNA的質(zhì)粒檢測(cè)電子顯微鏡
程是相似的。熒光蛋白嵌合體通常在N端或C端加入融合結(jié)構(gòu)。2．
獲取目的蛋白N端或C端結(jié)構(gòu)一功能的知識(shí)將有助于避免干擾母體蛋
白的功能和／或
定位。而且，了解每個(gè)末端表達(dá)定位的亞細(xì)胞環(huán)境對(duì)嵌合體的設(shè)
計(jì)將是有用的。例
如，如果可能的話，避免把GFP加入到酸性蛋白水解環(huán)境中的蛋
白末端(如溶酶體
內(nèi)腔)，如果沒(méi)有相關(guān)知識(shí)，最初可制備N(xiāo)端和C端都連接GFP的嵌
合體。3a．末端插入連接子：如果N端和C端都包含決定目標(biāo)蛋白功
能和定位的結(jié)構(gòu)域，則
在它和熒光蛋白之間插入短的連接肽以減少位阻的影響。3b．
包埋插入：也可以把熒光蛋白插入到分子的基本序列中，通常在未
結(jié)構(gòu)化的環(huán)形
區(qū)域內(nèi)。如果其他方法失敗可考慮此種方法，但不能保證成功
。4．某些情況下，把編碼熒光蛋白的eDNA插入含有編碼目標(biāo)蛋白D
NA的質(zhì)粒更容易。
此時(shí)，根據(jù)目標(biāo)蛋白是N端融合還是C端融合，應(yīng)格外注意熒光蛋
白的5’端和
3’端。5．如果產(chǎn)生的是N端融合(指GFP連接到目標(biāo)蛋白的N端)
，貝Ⅱ必須合理設(shè)計(jì)GFP
編碼區(qū)域的兩個(gè)末端。把Kozak序列和GFP翻譯起始密碼子結(jié)合起
來(lái)將會(huì)保證
mRNA的高效翻譯，同時(shí)應(yīng)該刪除GFP的終止密碼子或者將其轉(zhuǎn)化
成編碼氨基酸。6．如果產(chǎn)生的是C端的融合，則刪除目標(biāo)蛋白的終
止密碼，或者將其轉(zhuǎn)化為一個(gè)編碼
氨基酸；保存GFP的終止密碼子。7．另外也可以把編碼目標(biāo)蛋白
的cDNA插入到含有編碼熒光蛋白DNA的質(zhì)粒中。在
很多情況下，這種方法更簡(jiǎn)單，因?yàn)樵S多可以表達(dá)熒光蛋白的質(zhì)
�？梢再I(mǎi)到。這些
質(zhì)粒通常包含一個(gè)巨細(xì)胞病毒(CMV)連接的早期啟動(dòng)子(在哺乳動(dòng)
物細(xì)胞內(nèi)高效
表達(dá))，一個(gè)包含了許多獨(dú)特的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的多
克隆位點(diǎn)(MCS)
(促進(jìn)嵌合體的產(chǎn)生)，一個(gè)可使質(zhì)粒在細(xì)菌種選擇性擴(kuò)增的具抗
生素抗性的區(qū)域，
通常包括G418篩選基因。與上面所描述的熒光蛋白的插入一樣，
目標(biāo)蛋白插入到
這些質(zhì)粒中也具有同樣的限制。8．如果產(chǎn)生的是C端融合，則把
目標(biāo)蛋白的eDNA插入到一個(gè)熒光蛋白編碼序列的5’
端含有MCS的質(zhì)粒中。刪除目標(biāo)蛋白的終止密碼子，或者將其轉(zhuǎn)
化為一個(gè)編碼氨基
酸，插入一個(gè)含有目標(biāo)蛋白翻譯密碼子的Kozak序列。9．如果產(chǎn)
生的是N端融合，則把目標(biāo)蛋白的eDNA插入到一個(gè)熒光蛋白編碼序
列3’端
含有MCS的質(zhì)粒中(熒光蛋白編碼區(qū)的翻譯起始段含有Kozak序列)
。刪除熒光蛋
白終止密碼子，或者將其轉(zhuǎn)化為一個(gè)編碼氨基酸；保存目標(biāo)蛋白
的終止密碼子。
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