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本文標(biāo)題："熒光蛋白嵌合體通常在N端或C端加入融合結(jié)構(gòu)"
新聞來源：未知 發(fā)布時間：2017-3-13 1:07:00 本站主頁地址：http://www.y7853.cn
熒光蛋白嵌合體通常在N端或C端加入融合結(jié)構(gòu)
程是相似的。熒光蛋白嵌合體通常在N端或C端加入融合結(jié)構(gòu)。2．
獲取目的蛋白N端或C端結(jié)構(gòu)一功能的知識將有助于避免干擾母體蛋
白的功能和／或
定位。而且，了解每個末端表達(dá)定位的亞細(xì)胞環(huán)境對嵌合體的設(shè)
計將是有用的。例
如，如果可能的話，避免把GFP加入到酸性蛋白水解環(huán)境中的蛋
白末端(如溶酶體
內(nèi)腔)，如果沒有相關(guān)知識，最初可制備N端和C端都連接GFP的嵌
合體。3a．末端插入連接子：如果N端和C端都包含決定目標(biāo)蛋白功
能和定位的結(jié)構(gòu)域，則
在它和熒光蛋白之間插入短的連接肽以減少位阻的影響。3b．
包埋插入：也可以把熒光蛋白插入到分子的基本序列中，通常在未
結(jié)構(gòu)化的環(huán)形
區(qū)域內(nèi)。如果其他方法失敗可考慮此種方法，但不能保證成功
。4．某些情況下，把編碼熒光蛋白的eDNA插入含有編碼目標(biāo)蛋白D
NA的質(zhì)粒更容易。
此時，根據(jù)目標(biāo)蛋白是N端融合還是C端融合，應(yīng)格外注意熒光蛋
白的5’端和
3’端。5．如果產(chǎn)生的是N端融合(指GFP連接到目標(biāo)蛋白的N端)
，貝Ⅱ必須合理設(shè)計GFP
編碼區(qū)域的兩個末端。把Kozak序列和GFP翻譯起始密碼子結(jié)合起
來將會保證
mRNA的高效翻譯，同時應(yīng)該刪除GFP的終止密碼子或者將其轉(zhuǎn)化
成編碼氨基酸。6．如果產(chǎn)生的是C端的融合，則刪除目標(biāo)蛋白的終
止密碼，或者將其轉(zhuǎn)化為一個編碼
氨基酸；保存GFP的終止密碼子。7．另外也可以把編碼目標(biāo)蛋白
的cDNA插入到含有編碼熒光蛋白DNA的質(zhì)粒中。在
很多情況下，這種方法更簡單，因為許多可以表達(dá)熒光蛋白的質(zhì)
粒可以買到。這些
質(zhì)粒通常包含一個巨細(xì)胞病毒(CMV)連接的早期啟動子(在哺乳動
物細(xì)胞內(nèi)高效
表達(dá))，一個包含了許多獨(dú)特的限制性核酸內(nèi)切酶識別位點的多
克隆位點(MCS)
(促進(jìn)嵌合體的產(chǎn)生)，一個可使質(zhì)粒在細(xì)菌種選擇性擴(kuò)增的具抗
生素抗性的區(qū)域，
通常包括G418篩選基因。與上面所描述的熒光蛋白的插入一樣，
目標(biāo)蛋白插入到
這些質(zhì)粒中也具有同樣的限制。8．如果產(chǎn)生的是C端融合，則把
目標(biāo)蛋白的eDNA插入到一個熒光蛋白編碼序列的5’
端含有MCS的質(zhì)粒中。刪除目標(biāo)蛋白的終止密碼子，或者將其轉(zhuǎn)
化為一個編碼氨基
酸，插入一個含有目標(biāo)蛋白翻譯密碼子的Kozak序列。9．如果產(chǎn)
生的是N端融合，則把目標(biāo)蛋白的eDNA插入到一個熒光蛋白編碼序
列3’端
含有MCS的質(zhì)粒中(熒光蛋白編碼區(qū)的翻譯起始段含有Kozak序列)
。刪除熒光蛋
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